细胞自噬的实验技术

细胞死亡：

程序性死亡和非程序性死亡

细胞凋亡：称为Ⅰ型程序性细胞死亡。

细胞坏死：细胞对外界损伤刺激的一种非程序性死亡方式。

细胞自噬：？

三者有什么区别呢？

细胞凋亡：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出牙脱落，最后被具有吞噬功能的细胞吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。

细胞坏死：细胞肿大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。

细胞自噬：细胞在遇到营养缺乏、不良折叠的蛋白、氧化应激、离子射线及毒物等不利情况下采取的一种适应性反应。首先是细胞质和细胞器被双层膜包裹形成自噬泡，然后再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最终使被包裹的细胞质和细胞器降解。降解成分可作为其他蛋白合成的原料。

自噬概念

自噬(autophagy)是II型程序性细胞死亡（凋亡、铁死亡、焦亡也都属于程序性死亡）。是指细胞利用溶酶体降解，选择性地清除自身受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，释放出游离小分子供细胞回收利用的正常动态生命过程。自噬被认为是机体的一种自我保护机制。（自噬过度也是一种不好的行为）。

自噬分为：

巨自噬（macroautophagy）：细胞的整个区域被包围在双膜小泡的自噬体中，这些自噬体然后与溶酶体融合成为自噬溶酶体，其内容物随后被其中的蛋白酶降解。一般情况下所说的自噬是指巨自噬。

微自噬（microautophagy) ：细胞器或是内含物的囊泡直接与溶酶体相互作用并融合，微自噬比巨自噬更具特异性，可由受损细胞器表面的信号分子触发。

介导自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA）：也称为伴侣介导的自噬，胞质内的蛋白质通过胞质伴侣与溶酶体融合，通过分子伴侣与底物氨基酸序列内的五肽相互作用，例如底物蛋白与溶酶体LAMP-2A，并被转运到溶酶体中进行降解。

自噬的本质其实是细胞内的膜重排，其发生过程大体分为以下4个阶段：

自噬的起始→ 隔离膜和自噬体的形成→ 自噬体与溶酶体融合→ 自噬体的裂解

步骤一：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，有点像半球形，就像一个由2层脂双层组成的碗，会包裹住受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器。这样类似碗状的结构可在电镜下观察到，被称为Phagophore（自噬泡），是自噬发生的铁证之一。

步骤二：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome（自噬体）。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。

步骤三：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合。

步骤四：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome（自噬溶酶体），期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

自噬特性

①消化自身：看似对细胞不利，事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。

②过程很快：被诱导后8min即可观察到自噬体形成，2h后自噬溶酶体基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。

③可诱导特性：表现在2个方面，一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。批量降解：是与蛋白酶体降解途径的显著区别。

④“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。

⑤保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来。

自噬调控

细胞基础水平的自噬活性很低，不适于观察，因此对自噬研究多需人工干预。

目前常用的自噬激动剂有Rapamycin和EBSS等，常用的自噬抑制剂有Chloroquine、3-MA、NH4Cl和 Bafilomycin A1等。

雷帕霉素 (rapamycin,RAPA)可通过抑制m TOR通路,诱导和促进细胞自噬的发生。

EBSS诱导自噬是一种常用的实验方法，用于研究细胞自噬过程。 EBSS是一种低营养培养基，其中不含氨基酸和葡萄糖等营养物质，可以诱导细胞进入自噬状态。

这些自噬激动剂和抑制剂可以分别激活/抑制自噬发生的不同阶段，需要根据具体研究的信号通路/物质，选择合适的激动剂或抑制剂。

自噬的检测方法

在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下会显著上调。另外，自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病等。

选择理想的检测方法对于自噬研究至关重要。

常用的观察和检测方法有以下几种：

1 透射电镜检测

2 MDC染色

3 双荧光穿梭质粒系统检测

4 单荧光质粒系统检测

5 WB检测

下面介绍一下这五种检测方法：

1 透射电镜检测 

自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。

2 MDC染色

MDC，是一种使用丹酰尸胺，也称单丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺，作为荧光探针快速便捷地检测细胞自噬的试剂盒。

MDC是细胞自噬检测常用的荧光探针之一。MDC可以通过离子捕获和与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬体，因而常用于细胞自噬的检测。

MDC是一种嗜酸性荧光探针，很多酸性膜性结构也会被MDC染色，因此MDC染色时正常的细胞也会有一定的染色背景。

3 双荧光穿梭质粒系统检测

自噬形成时，mRFP-GFP-LC3质粒转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄 色荧光斑点。

当自噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光。

表达mRFP-GFP-LC3的小鼠胚胎成纤维细胞（左）接受饥饿处理（2小时），其中（右）或（中）不添加100 nM巴菲霉素A1（抑制自噬小体/溶酶体融合）。中间的黄 色（自噬小体）和红色（自噬溶酶体）斑点都增加了，而右边的大多数斑点都是黄 色的（自噬小体）

4 单荧光质粒系统检测

利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：

无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；

自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

5 WB检测

LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。

LC3亚型有：LC3A、LC3B和LC3C。

WB检测虽然是自噬最经典、公认的检测方法，但是在实际课题研究中，只有WB检测证明自噬的发生还不够。有条件建议增加其它检测方法进行证明。如果实验条件不允许，可以在实验分组中增加自噬的抑制剂、自噬的激动剂做拯救实验，正反证明自噬的发生。