干货分享 | IP免疫沉淀技术详细解析
2024-08-16 来自: 长沙东晟生物技术有限公司 浏览次数:69
IP（免疫沉淀）的概念
IP（免疫沉淀）：一种利用特异性抗体结合抗原，并通过沉淀富集的方式从复杂的样本中分离出目标蛋白的方法。主要用于从复杂的生物样本中分离和纯化单一特定蛋白质，依赖于抗体对目标蛋白的特异性识别并形成抗原-抗体复合物，然后通过物理方法（如琼脂糖珠或磁珠 ）将这些复合物沉淀下来，再结合Western blot（WB）或质谱（mass spectrum，MS）对目标蛋白进行检测分析，即可对目标蛋白进行定性/定量分析。
与传统的柱式亲和纯化相比，免疫沉淀的目标是仅分离足够用于Western Blot或其他检测方法检测的蛋白质。通常可以将已处理和未处理的样品进行比较，从而评估目标蛋白的相对量。
IP（免疫沉淀）的目的及原理
IP主要实验目的
1.鉴定特定蛋白的存在和表达水平；
2.研究蛋白的翻译后修饰，如磷酸化、甲基化等；
3.确定蛋白复合物的形成；
4.纯化目的蛋白以进行进一步的分析。
IP实验原理
将含有目的蛋白的样品溶液与特异性抗体结合，该抗体的Fc片段又能结合到protein A/G上，protein A/G（结合了protein A和protein B的IgG结合结构域，具有与IgG的Fc片段特异性结合的能力，可用于抗体的亲和纯化。）通常会固定在琼脂糖珠或磁珠上，进而吸附目的蛋白，后续再通过离心收集、洗脱、溶解等步骤分离获得目的蛋白。
IP（免疫沉淀）的抗体
（1）预先固定特定抗体的免疫沉淀
特定蛋白的抗体（单克隆或多克隆）固定在固相支持物（如琼脂糖树脂或磁珠）上，随后与含有靶蛋白的细胞裂解物一起孵育。在孵育期间，轻轻搅动裂解物使目标抗原结合到固定抗体上，形成抗原-抗体免疫复合物。随后，将免疫复合物从固相支持物上洗脱，进行目标抗原的性质分析。
（2）游离抗体的免疫沉淀
游离的抗体加入裂解物中形成免疫复合物，然后利用固相支持物回收抗原-抗体免疫复合物。随后，将免疫复合物从固相支持物上洗脱，进行目标抗原的性质分析。
当靶蛋白丰度较低、抗体与抗原的亲和力较弱，则使用游离抗体形成免疫复合物的方法更好。
抗体的固定
Protein A/G结合抗体
Protein A/G是抗体的结合蛋白，对多种不同亚类和种属的抗体具有较高的亲和力。如图所示， Protein A/G与抗体的Fc结合，将其正确固定，以便沉淀目标抗原。
Protein A/G支持物不适合某些特定的免疫沉淀实验系统，例如当免疫沉淀抗体的种属或亚类不与这些蛋白结合，或者当含有抗原的样本是血清时（血清中包含的抗体会与免疫沉淀抗体竞争结合）。
使用交联剂固定抗体
除了用Protein A/G直接捕获抗体外，还可以使用交联剂将抗体共价连接到Protein A/G上。常用的交联剂包括DSS和BS3，它们是具有胺基反应性的NHS基团的短碳链。NHS可与伯胺（赖氨酸残基的侧链）反应，生成共价酰胺键。如果抗体先与Protein A/G支持物结合，然后再与交联剂溶液混合，则交联剂分子可与抗体和Protein A/G相邻的胺基共价连接。交联方法可以避免抗体片段共洗脱，并可重复多次使用。该方法只适用于可与Protein A/G结合的抗体。由于抗体包含多个胺基基团，且不仅只分布于Fc区段，因此必 须优化交联剂的用量。如果交联剂用量过少或过多，则抗体可能无法连接至Protein A/G上，或者引起抗体结合位点上的胺基基团被过度修饰，进而导致抗体无法与抗原结合。
链霉亲和素微珠结合抗体
除了Protein A/G结合抗体外，也可以用链霉亲和素微珠去捕获抗体，这要求抗体是被生物素化的。
IP（免疫沉淀）固相物质的选择与比较
对于小型特定蛋白和蛋白复合物的分离，磁珠可实现结合能力、得率、可重复性、纯度和成本节约之间的平衡。当进行标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反应并立即用于后续检测分析时，磁珠是最佳选择，利用强力磁力架可将磁珠定位到孵育管的侧壁，使其不阻碍细胞裂解物抽吸，磁性分离不需要离心，所以不会导致抗体-抗原结合破坏和目标蛋白损失现象。当需要纯化大量目标蛋白用于下游分析，且特异性抗体较易获得，琼脂糖树脂纯化较为适用。
IP（免疫沉淀）的分类
IP（免疫沉淀）主要用于分离单个蛋白（抗体的靶抗原）以研究其特性、结果、表达、活化或修饰状态。IP也用于研究初级抗体/蛋白与其他蛋白或核酸的相互作用。
免疫共沉淀（Co-IP）
免疫共沉淀是研究蛋白质相互作用的常见技术，使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白质，来识别生理相关的蛋白质-蛋白质相互作用。
免疫共沉淀（Co-IP）是利用免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用，或者利用已知蛋白寻找与之相互作用的未知蛋白。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来，用诱饵蛋白抗体免疫沉淀诱饵蛋白，那么与诱饵蛋白在体内结合的靶蛋白也被沉淀下来，随后利用蛋白印迹（western blot，WB）检测沉淀中是否存在靶蛋白，如果存在，则说明细胞内诱饵蛋白和靶蛋白存在相互作用。相较于其他分子间相互作用检测方法（GST pull down等），Co-IP的优势在于蛋白的结合在细胞内完成，能够反应天然状态下的蛋白质相互作用，结果更加真实可靠,但无法确定是直接相互作用还是间接相互作用。
染色质免疫共沉淀（ChIP）
染色质免疫沉淀分析是用来研究蛋白质与DNA是否在体内存在相互作用，常用来检测转录因子结合位点。
（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质甲醛交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，再通过DNA纯化和多种下游检测技术（定量PCR、基因芯片、测序等）来检测此富集片段的DNA序列。
RNA免疫共沉淀（RIP）
RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RIP）一种研究细胞内RNA与蛋白质结合的技术。RNA是一种不稳定的生物大分子，大多数RNA需要与特定的RNA结合蛋白结合，形成RNA /蛋白质复合物，才能在细胞中保持稳定。因此，利用RNA结合蛋白分离或发现有功能的RNA分子是RNA研究领域不可或缺的研究方法。RNA免疫共沉淀(RIP)实验利用针对目的蛋白的抗体沉淀相应的RNA-蛋白复合物，分离纯化后可通过q-PCR或测序分析验证与复合物结合的RNA。它是了解该网络转录后调控动态过程的有力工具，可以帮助我们发现mirna的调控靶点 。
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