干货分享 | pull-down（下拉实验）详细解析
2024-08-19 来自: 长沙东晟生物技术有限公司 浏览次数:1787
接上篇，本篇小编为大家介绍一下pull-down实验，又称“下拉实验”，是一种体外亲和纯化技术，用于考察蛋白之间的互作关系。
pull-down（下拉实验）的原理
pull-down实验，即下拉实验，也称为体外蛋白结合实验，用以确定已知蛋白和未知蛋白间的互作关系。通过将已知蛋白作为诱饵蛋白，用生物素-、PolyHis-或GST-等标签对其进行标记，然后将诱饵蛋白固定在与其亲和的固相支持物上充当诱饵，与蛋白样品或细胞/组织裂解液共孵育，可捕获样品中与诱饵蛋白互作的蛋白，接着通过洗涤或洗脱过程去除其余物质，并将捕获的蛋白回收，进行WB或质谱等检测分析。目前pull-down中应用是广泛的融合标签是GST（g l u t a t h i o n e-S-transferase，谷 胱 甘 肽-S-转移酶）。
pull-down（下拉实验）的目的
1.互作蛋白的识别：鉴定特定蛋白质的互作伙伴，揭示蛋白质相互作用网络，有助于理解细胞信号传递和调控的机制。
2.功能分析：通过确定互作蛋白，可以推断目标蛋白的功能和调控途径。例如，某个蛋白质的互作伙伴可能是其底物、调控因子或抑制剂。
3.蛋白质复合物的研究：pull down实验可用于研究蛋白质复合物的组成和结构。通过确定复合物成员及其相互作用方式，可以深入了解复杂的蛋白质互作网络。
pull-down（下拉实验）的分类
GST pull down是常用的蛋白与蛋白互作实验方法，利用重组技术将探针蛋白与GST谷胱苷肽巯基转移酶融合，融合蛋白通过GST与固相化在球珠上的GSH谷胱甘肽结合，从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白。
DNA pull-down技术是一种用于研究蛋白质与DNA之间相互作用的实验方法。其原理基于蛋白质与特定DNA序列之间的亲和性，通过特定的DNA探针捕获与其结合的蛋白质，从而实现对蛋白质-DNA复合物的富集和分析。
RNA pull-down实验是将RNA进行生物素探针标记，捕获与其结合的蛋白质，从而实现对蛋白质-DNA复合物的富集和分析。目前RNA pull-down技术已成为研究miRNA、lncRNA与相互作用蛋白的主要技术手段之一。
RNA-RNA pull-down是检测RNA与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA-RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，捕获与其结合的RNA，通过qRT-PCR实验检测特定的RNA是否与靶标RNA相互作用。
IP和pull-down的区别
实验问题：Input中无条带，但IP中有
可能原因：Input中无条带但IP中有可能是目的蛋白丰度低，WB的一抗不够灵敏，而经IP富集后可检测到；洗脱条件不适宜。
解决方案：第一种情况可以选择灵敏度更高的抗体，或通过外源性过表达来提高目的蛋白的丰度；可使用多种洗脱缓冲液进行比较，找到最合适的洗脱条件。一般可分为变性洗脱和非变性洗脱。变性洗脱是用SDS-PAGE上样缓冲液使蛋白变性，可有效解离抗原-抗体的亲和作用，方便后续做WB检测。如果后续需要进行功能性分析，则需要使用非变性的酸性洗脱法（0.1M甘氨酸，pH2.5-3），可解离大多数抗原-抗体互作的同时保留目的蛋白的活性。
相反Input中有条带，而IP中没有
可能原因：可能是IP所用的抗体是识别蛋白内部的线性表位，而不是构象表位，导致无法捕获目的蛋白。
解决方案：在兼顾抗体特异性的同时，选择适用于IP的抗体是关键。
GST pull-down实验结果含有大量背景信号和减少GST pull-down中的假阳性结果如何解决？
背景信号可能来自于非特异性结合。可以尝试增加洗脱步骤次数、使用更严格的洗脱条件，或添加非特异性结合抑制剂如BSA。
假阳性结果主要是由于自发形成的聚集态，非特异的吸附和其他非特异性相互作用引起的。为了减少GST pull-down中的假阳性结果，通过添加更多的非离子型洗涤剂和用特定的pH缓冲液来消除这些非特异性的互作，同时在检测前应该用0.1％的Tween-20（或其他洗涤剂）处理GST-beads。
IP和pull down都能检测互作，那Co-IP能验证到互作，为什么GST pull-down却验证不到？
Co-IP是体内实验，可能检测到基于其他蛋白作为桥梁的间接互作，而GST pull-down证明的是两个蛋白的直接相互作用，如果中间桥梁缺失，则不会呈现互作状态。
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