生物小白的入门必修课（3）| 细胞培养的相关问题
2024-08-27 来自: 长沙东晟生物技术有限公司 浏览次数:53
细胞污染
培养细胞的污染概念不仅仅指微生物，而是包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物。因此，一般包括微生物(真菌、细菌、病毒和支原体)、化学物质(影响细胞生存、非细胞所需的化学成分)及细胞(非同一种的其他细胞)等。其中以微生物污染很多见。另外随着细胞种类增多，不同种细胞交叉污染也时有发生，从而造成细胞不纯。化学物质污染则较少。
1.细菌污染
污染来源：操作不规范或无菌措施不到位等。
常见菌种：白色葡萄球菌、大肠杆菌、假单孢菌、枯草杆菌等。
污染特征：显微镜下可观察到大小不一（0.5～5μm）的物质，比细胞小很多，低倍镜下呈沙粒状布满细胞间隙或培养基，高倍镜下多呈球状或杆状，形态规则，分布均匀，镜下观察有明显的定向运动；增殖速度快，一般污染后48~72h爆发式增殖；营养消耗快，培养基pH发生变化，颜色很快变黄，变浑浊，甚至可能有明显的异味；细胞生长缓慢，形态发生改变甚至脱落死亡。
处理建议：轻度污染或细胞比较珍贵：可用10～20×双抗清洗处理。重度污染建议直接消杀丢弃后对培养箱进行彻 底消毒。为预防细菌感染，建议日常培养基中正常添加双抗。
293细胞：在低倍显微镜下，贴壁细胞之间有一些发亮的微小颗粒，但单个细菌不易区分（图A）。进一步放大黑色正方形框出的区域后，可以显现出单个大肠杆菌细胞，这些细胞通常呈杆状，长约2μm，直径约0.5μm 。
2.真菌污染
污染来源：一般是来自实验服，并且具有气候性，多雨、气候湿润的季节容易出现。
常见菌种：曲霉菌、白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌、孢子菌等。
污染特征：肉眼下可观察到培养液中有淡黄色或是白色的点状漂浮物，短期内培养基一般不变混浊。倒置显微镜下可见细胞之间有絮状交错的菌丝或菌团，在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。细胞被污染后仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。
处理建议：在PBS润洗、换液后可加入两性霉素B（注意两性霉素B有细胞毒性，使用后可能会有副作用），也可加入300μg/mL氟康唑培养，污染控制后改用150μg/mL培养2~3代。但真菌污染一般难以根除，若非必要，建议消杀后丢弃，对细胞房、培养箱、操作台以及器皿和培养液等进行全面消毒。
3.支原体污染
污染来源：血清、胰酶、已污染物的气溶胶、操作人员的口腔及皮肤等。
常见菌种：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体等。直径约为 0.1～0.3 μm，具有变形能力，可通过过滤膜（0.22-0.45 μm）。
污染特征：最小的微生物，无法通过光学显微镜看见，但可通过电镜观察到。感染支原体的细胞，在某一时间点碎片突然增多，随着传代，细胞状态显著变差。支原体污染可通过气溶胶传播，影响同一细胞房其他细胞。培养条件未变，培养基清澈；更换新的培养液，细胞状态没有恢复。
处理建议：支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。
4.黑胶虫污染
污染来源：“黑胶虫”是一种常见的细胞污染物，暂无明确定义，可存在于动物细胞，也可以生存于培养基中，随细胞传代而传代，是一种异养物质，主要来源为血清。
污染特征：主要表现为细胞状态差，培养基不浑浊，但镜下观察细胞周围和培养液中出现很多黑点和碎片多，做布朗运动，且随着培养时间的延长黑点和碎片逐渐增多，更换培养液或洗涤不能将其去除；“黑胶虫”与细胞竞争性生长，严重时导致细胞死亡，细胞增殖旺盛之后会自然消失。
处理建议：对于黑胶虫污染的细胞，最快速有效的处理方式是使用黑胶虫清除剂，同时确保培养体系中的血清必须为无黑胶虫污染的优质血清。非珍稀或污染严重细胞建议直接丢弃。
5.细胞交叉污染
污染来源：细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会出现细胞交叉污染。目前，已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。
鉴定方式：同种属：进行STR鉴定，多等位基因数大于3个。不同种属：PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。
处理建议：建议重新引种。
预防建议：尽量避免多细胞同时操作，如传代等；器具和培养溶液避免交叉使用。
细胞房规范操作流程
1.进入细胞房前穿戴实验服、口罩、手套及鞋套等，用消毒酒精擦拭双手；
2.实验前准备：提前0.5～1h打开超净台紫外灯进行消毒，同时将足量所需试剂、耗材等放置于消毒窗口，打开紫外灯进行消毒；
3.按照个人习惯摆放试剂、耗材及仪器，切勿置于生物安全柜进出风口；
4.操作要准确、敏捷、有序，尽量减少试剂和细胞瓶的敞口时间；专管专用，避免交叉污染；
5.操作完成后，将试剂放回原位；丢弃废物和废液；用酒精擦拭台面进行消毒；打开超净台及细胞房紫外灯，至少照射15min进行消毒；
6.定期清理建议；环境消毒：每周一次定期消毒灭菌。
环境消毒
1.地面/墙面：84消毒液、新洁尔灭交叉使用；
2.环境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸；
3.仪器设备表面：75%酒精擦拭，培养箱、显微镜托盘等高风险区域需经常清洁，培养箱水盘和复苏用的水浴锅需添加抑菌剂；
4.耗材消毒：需重复使用的耗材确保按照规定清洗、高温高压灭菌，使用灭菌指示带。灭菌后烘干的耗材立刻放进超净台，一周内使用完毕，未使用完的，需重新灭菌再使用；
5.定期进行沉降菌检测。
以上，本期的细胞培养知识就已经全部结束，希望各位生物小白能够有所进步。学会的扣1，没学会的自废双手！
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