酵母双杂交系统详细解析！！（2）
2024-09-29 来自: 长沙东晟生物技术有限公司 浏览次数:462
6.酵母双杂交系统常用的菌种
常见的菌种有Y2HGold、AH109、Y187。
AH109菌株：Trp和Leu缺陷型菌株，无法在缺少Trp和Leu的培养基中生长，因此可以用来进行转化筛选。
这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成Leu、Trp、His、Ade，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，使得酵母可在-Ade、-His营养缺陷型培养基上生长，同时表达α-半乳糖苷酶，使X-α-Gal显色底物变蓝。从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。
Y2HGold、AH109菌株它们共有的筛选标记为Trp1和Leu2，共有的报告基因为HIS3，ADE2，MEL1。AH109特有报告基因为lacZ，Y2HGold特有的报告基因为AbAr。
酿酒酵母交配是细胞与细胞融合的典型事件。酿酒酵母具有两种不同的单倍体细胞类型，分别为MATa型（a型）和MATα型（α型）。当这两种交配型的细胞紧密靠近时，它们可以融合成为二倍体细胞（MATa/α型）。Y2HGold和AH109都属于a型酵母，Y187属于α型酵母。所以Y2HGold、AH109均可以与Y187融合，但是AH109和Y2HGold不能发生融合。
7. 酵母双杂交系统的转化方式
酵母双杂交系统的转化方式分为三种：分步转化、共转、mating。
共转：把连有目的基因的BD、AD同时转化到感受态细胞中，然后用二缺培养基（SD/-Leu-Trp）筛选转化子。常用于互作验证。
分步转化：常用于文库筛选，文库形式为质粒文库或者cDNA，指的是先将诱饵转化到Y2HGold或AH109酵母感受态细胞中，然后再将文库转化到已经包含诱饵的感受态细胞中。分步转化得到的转化子更多，意味着有更多的文库基因参与到互作筛选中。
Mating： 指的是将两个质粒（其中一个可为文库质粒）分别转入两个不同类型（a型和α型）酵母菌中，利用两个不用类型的酵母细胞可以融合成为二倍体的特性，从而将两个质粒构建到同一个酵母细胞中。常用于在文库筛选实验中，如果文库是酵母菌库的形式。
8.酵母双杂交系统的筛选
AD是质粒pGADT7的简称，携带Leu基因，BD是质粒pGBKT7的简称，携带Trp基因。
SD/-Leu-Trp表示缺亮氨酸和色氨酸的培养基，也就是二缺板，可以看出三组实验都长出了酵母菌落，也就是两个质粒都转入酵母菌株，酵母菌株就可以在对应的二缺板上生长。
SD/-Leu-Trp-His-Ade表示缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基，也就是四缺板，从图中可以看出在四缺板上只有实验组的酵母菌株能够生长，两个对照组的酵母菌株无法生长，这一结果就证明了SPX6与PHR2存在互作。其背后的原理是SPX6与PHR2存在互作就会重组成有功能的Gal4转录因子，Gal4激活下游的报告基因His和Ade的表达，酵母菌株就能合成组氨酸与腺嘌呤，加上AD和BD上携带的营养标记基因，其对应的酵母菌株就能在四缺板上生长。
9.1酵母双杂交系统的自激活
自激活现象：理论上BD可单独与GAL4上游活化序列UAS结合，但不能引起转录。但是如果将一段具有转录激活活性的转录因子作为诱饵蛋白bait构建到BD载体上，其表达产生的诱饵蛋白单独与UAS结合后能引起下游报告基因的转录的现象。
另外酵母细胞的某些具有转录激活活性的内源蛋白也可能与诱饵蛋白互作。这样就无法判断报告基因的表达是不是由于bait和prey互作导致的。所以只有在排除自激活的基础上，才能判断bait和prey是否互作。在互作验证中，如果不进行自激活检测，不设对照组，而直接进行互作验证，无法判断实验结果是否可信；在文库筛选实验中，如果不进行自激活检测，而直接进行文库筛选，极有可能得到大量的假阳性转化子，增加后期数据处理的难度。
具体的做法是将需要研究的基因A构建至BD载体上，即pGBKT7-A与AD空载体pGADT7共转酵母菌株，观察在三缺SD-Trp/-His/-Ade板上能否生长，若能生长，就证明基因A存在自激活活性，不能生长就说明基因A不存在自激活活性，只有在基因A不存在自激活活性的情况下才能进行后续的双杂实验。
常用双杂自激活检测的报告基因只有AbAr+MEL1组合或者HIS3，还有用AbA和3-AT抑制自激活。
9.2酵母双杂交系统的自激活
常用双杂自激活检测的报告基因只有AbAr+MEL1组合或者HIS3，还有用AbA和3-AT抑制自激活。
AbA 作用机制是抑制酵母中AUR1基因（1,2）编码的肌醇磷酰胺（inositolphosphorylceramide，IPC）合成酶的活性，干扰鞘脂合成，从而杀死菌株。Y2HGold的报告基因AbAr被激活后，可以使酵母菌对AbA产生抗性。同时利用AbA（金担子素），可以抑制报告基因AbAr范围内的自激活。
MEL1编码分泌α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色底物。X-α-Gal是酵母α-半乳糖甘酶（MEL1）的反应底物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色，即阳性的双杂交作用。X-α-Gal可在培养基上直接检测酵母双杂交相互作用。
X-Gal用于检测LacZ基因合成的 β-半乳糖苷酶的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母细胞后通过加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays才能进行显色，因此操作流程相对繁琐。
HIS3编码组氨酸，而3-AT是组氨酸的竞争性抑制剂，可以抑制HIS3的泄露表达和轻微自激活现象。
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