酵母双杂交系统详细解析！！（1）
2024-09-26 来自: 长沙东晟生物技术有限公司 浏览次数:298
1.酵母双杂交系统的建立和原理
酵母双杂交系统的建立：
酵母双杂交技术早在1989年由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时基于对真核生物调控转录起始过程的认识建立的，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的protein-protein互作研究技术，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白互作的鉴定和验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。
酵母双杂交系统的原理：
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子 GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构组成的，可以分开的，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
2.酵母双杂交系统图解
在酵母双杂交系统中，“诱饵”（bait）蛋白X构建至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；“猎物”（prey）蛋白（待测试蛋白Y）构建至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。
如果bait和prey之间没有相互作用，BD和AD就不会与激活序列结合，报告基因也就不能被激活和表达；反之如果在酵母内，bait和prey相互作用且表达了，那么BD和AD就会与激活序列结合，下游报告基因（抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等）也就被激活并进行表达。
故bait和prey是否发生相互作用，即可通过对报告基因的激活表达与否进行检测。
3.酵母双杂交系统的应用原因
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
4.酵母双杂交系统的报告基因
与大肠杆菌采用抗生素筛选的策略不同，酵母系统常采用营养标记作为报告基因。常用的报告基因有 His3，Ura3，Leu2 和 Ade2 等，对应的宿主菌则是相应标记的缺陷型细胞，要在含有该营养标记的培养基中才能生长。
Gal4系统中的酵母菌种经过了基因改造后既不能产生Gal4，又不能合成组氨酸（His）、尿嘧啶（Ura）、亮氨酸（Leu）、腺嘌呤（Ade）等，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。只有当转入对应的质粒且相互作用的蛋白存在时，才能激活报告基因的表达，从而通过功能互补，酵母才能够在不含营养标记的培养基中生长，据此来验证两个蛋白是否存在相互作用。同样，也可以通过显色反应进一步确认是否有相互作用。
5.酵母双杂交系统常用的质粒
常用的载体为pGBKT7和pGADT7。两种载体均为穿梭载体，同时包含大肠杆菌和酵母菌的复制起始位点，并含有不同的抗性以及氨基酸缺陷型筛选标记。
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