生物小白的入门必修课（2）| 细胞培养的操作流程

Q：细胞有哪些分类？

1. 原代细胞：将细胞直接从生物体中分离后培养的细胞（10代之内）

2. 细胞系：经原代培养后，可继续进行传代培养的细胞

3. 细胞株：从细胞系中筛选出具有特殊性质或标记物的单细胞，并增殖得到的细胞群

4. 有限细胞系：正常细胞系通常只能分裂有限次数

5. 无限细胞系：在自然突变或物理化学因素的影响下发生转化，获得无线分裂能力，成为无限细胞系

6. 肿瘤细胞系：有些细胞可能发生恶性突变获得类似肿瘤细胞的特性

Q：细胞培养的基础操作是哪些？

培养细胞的传代及日常维持过程中在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费;而且细胞一旦离开活体开始体外培养，它的各种生物学特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的增加和体外环境条件的改变而不断有新的变化。因此，及时进行细胞冻存是非常关键和必要的。现在细胞低温冷冻储存已成为细胞培养室的常规工作和通用技术。细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以很大限度地保存细胞活力。

Q：细胞复苏有哪些注意事项？

1.细胞复苏注意无菌操作。

2.细胞复苏过程中,升温的速率要大,把从液氮或-80℃冰箱取出的细胞在短时间内放入37℃水浴锅。

3.细胞放入水浴中注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴锅中不时晃动,使其受热均匀,并防止水浴时水进入细胞冻存管污染细胞。打开细胞冻存管之前要用75%乙醇溶液棉球清洁管口,防止细菌污染。

4.液氮操作有一 定的危险,操作人员应该佩戴眼镜和手套取出细胞冻存管。复苏时若有液氮进入,请一 定要拧松冻存管盖,排出液氮,防止温度升高时爆炸。

Q：细胞传代是什么？

细胞传代培养不仅是一种将细胞种保存下去的方法，而且也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

一、实验目的

1. 扩增细胞数量

2. 避免因细胞进入平台期乃至衰亡期而大量死亡

二、实验原理

当培养的细胞增殖达到一 定密度后，将会出现密度抑制现象，表现为细胞的生长和分裂速度逐渐减慢，甚至停止。贴壁细胞会在培养瓶中长成致密单层 (悬浮细胞会充满整个体积的培养液)，铺满培养瓶底部，此时如果不及时进行分装再培养，即传代培养，细胞将逐渐走向衰老、死亡，将培养的细胞从一个容器以适当比率转移到其他容器中扩大培养，称为传代培养。

三、细胞传代的注意事项

1.对于贴壁细胞传代培养，通常采用0.25%胰蛋白酶很容易使细胞脱离瓶壁，但是，对于上皮组织来源的细胞需要采用消化作用更强的消化液，常用0.01EDTA-0.125%胰蛋白酶混合消化液。

2.使用含EDTA的消化液，务必进行离心洗涤细胞，除净EDTA，否则，影响细胞贴壁和生长。

3.吹打时动作要轻柔不要用力过猛同时尽可能不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤。

4.细胞传代比例依细胞生长速度而定，通常正常细胞传代比例为1:2~1:3，肿瘤细胞1:5~1:10。

5.细胞传代间隔时间要相对稳定，不要忽长忽短，以免影响培养细胞的生物学性状。

细胞培养—贴壁细胞

1. 选取生长密度 80%左右即处于生长对数期的细胞，在超净工作台中操作，吸去培养皿中的旧培养基，加入1-2 mL的PBS溶液，轻轻润洗，漂洗细胞以除去残留的血清。

2. 吸去培养皿中的PBS溶液，加入1-2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液（消化液能够覆盖细胞即可），吸弃培养基，将培养皿置37℃、5%CO2培养箱消化2～3 min(如消化程度不够，可延长时间)，倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含10%FBS的培养基终止消化。

3. 用移液枪轻柔吹打细胞使其成为细胞悬液。将细胞悬液转移到1.5mL离心管中，室温，1000 rpm，离心5 min。

4. 离心后，用吸引器轻轻吸去上清，加入1mL完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代（不同细胞特性不同，分盘比例适当调整），将1皿细胞的细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

5. 接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、细胞代数、本次传代日期和操作人姓名，轻轻摇匀后转移到37℃、5%CO2培养箱中培养。

6. 细胞培养 24 h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理或者进行冻存处理）。

假阳性结果主要是由于自发形成的聚集态，非特异的吸附和其他非特异性相互作用引起的。为了减少GST pull-down中的假阳性结果，通过添加更多的非离子型洗涤剂和用特定的pH缓冲液来消除这些非特异性的互作，同时在检测前应该用0.1％的Tween-20（或其他洗涤剂）处理GST-beads。

细胞培养—悬浮细胞

悬浮细胞不贴壁（半贴壁细胞贴壁不紧），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具体过程如下：

1. 取状态良好的细胞，在生物安全柜中操作，用移液管把细胞轻柔吹打均匀。

2. 把细胞悬液转移到15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。

3. 轻轻吸去上清后用完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

4. 接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、细胞代数、传代日期和操作人姓名．轻轻摇匀后转移到37℃、5%CO2培养箱中培养。

5. 细胞培养24 h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行后续相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理或者进行冻存处理）。

细胞冻存

1、配置冻存液:

（1）存活率比较高的细胞系，培养基、血清、DMSO按照7：2：1的比例新鲜配制使用。

（2）存活率较低的细胞系，或者需要长时间保存的细胞系，可以增加冻存液中的血清浓度，血清和DMSO按9：1的比例配制。

2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3、去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来(37℃, 3 min)。

4、加入培养液(含10% FBS)，来抑制Trypsin作用。

5、以200~300 xg，离心5 min，去除胰酶上清液。

6、加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密为5×106/mL～1×107/mL。

7、将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

8、冻存方法1：将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

冻存方法2：4℃冰箱放置30 min，转移至-20℃放置1 h，最后移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

细胞冻存注意事项

1.冻存的细胞需要细胞增殖旺盛,情况稳定,无 污 染,多处于对数生长期的细胞。

2.所有的细胞实验中均需要注意无菌操作。

3.细胞冻存液的配置要根据细胞的类型进行调整。

4.细胞冻存的过程,降温的速率要小。过快地降温,会导致细胞内形成冰晶引起细胞死亡。

5.冻存的细胞一 定要标记好名称、日期以及冻存人姓名等项目。

6.在细胞冻存的时候务必将冻存管拧紧。